基于毛細管電泳技術(CE)的PA800 plus生物制品分析系統

    貝克曼庫爾特公司于2009年發布了新的毛細管電泳系統PA800 plus，用于生物制品的研發及質量控制。目前毛細管電泳技術已經成為重組蛋白、單克隆抗體及純化疫苗等生物制品研發與質量控制中的關鍵技術之一，并在逐漸取代原有的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、等電聚焦凝膠電泳(IEF)等方法，作為生物制品純度測定、等電點確認、糖基化分析等方面的新標準。基于毛細管電泳技術的PA800 plus生物制品分析系統具有以下幾個獨特的優勢：

    · 高重復性，定量RSD < 1%，定性（pI）RSD < 0.1%；
    · 高分析速度，純度分析<30分鐘；pI測定<40分鐘；糖基化分析<15分鐘；
    · 自動化程度高；
    · 節省樣品和試劑，進樣量為納升級；
    · 糖基化分析具有極高的靈敏度；

     我們所熟知的重磅炸彈級蛋白質藥物(如Avastin、Herceptin、Rituxin及Xolair等)的研發與質量控制中無不使用CE技術。從培養基優化、克隆篩選、配方穩定性研究和純化過程監測，到蛋白質表征、相關雜質檢測、蛋白質結構鑒定和產品的質量控制，蛋白質藥物研發和生產的各個環節都需要使用到毛細管電泳。蛋白質的純度測定，已經從SDS-PAGE逐漸轉變為CE方法；蛋白質的等電點測定，毛細管等電聚焦比傳統膠條方法更為準確；糖蛋白藥物的糖基不均一性表征，毛細管電泳是高分辨率的方法。在擁有超過120臺CE的基因技術公司(Genetech，已被羅氏收購)實驗室中，幾乎所有的傳統電泳實驗，如SDS-PAGE純度檢測、IEF的等電點檢測和糖蛋白的糖基化分析都已經轉移到CE技術平臺上。在安進公司(Amgen)的實驗室中也有著由幾十臺CE所構成的龐大的質量分析和控制系統，負責所有出廠蛋白質藥物的質量控制(純度和異質性測定)。
 

    毛細管電泳技術在生物制品研發和質量控制中的發展

    毛細管電泳技術用于生物制品的研發與質量分析起始于美國的各大生物制藥公司。隨后這項技術迅速而廣泛地被歐洲、日本、新加坡等地的新藥研發和生產中心所接受，目前在生物制藥公司中運行的毛細管電泳儀已經超過600臺，而且使用量越來越大。
     由于越來越多的生物制藥公司使用毛細管電泳方法進行鑒定和質量分析，FDA等法規機構也開始關注對CE技術在生物制品分析中的適用性。在2006年，由惠氏、安進、基因技術、禮來、輝瑞、強生及加拿大衛生署等超過10個實驗室組成的項目研究小組對CE技術在生物制品分析中的穩定性、可靠性、準確性等多方面進行了研究和考察(Chromatographia, 2006, 64, 359-368)。研究結果表明CE技術比傳統的凝膠電泳方法更適合生物制品的表征與質量控制，結果的穩定可靠性要遠遠超過傳統使用的凝膠電泳技術。該正式建議各生物制藥公司使用CE技術代替原有的凝膠電泳技術作為研發與質量分析的平臺，同時也建議FDA等法規機構規定使用CE技術進行蛋白質相關藥物檢測。為了不斷追求更高的質量要求，拜耳制藥也曾向FDA其一例蛋白質藥物的原有SDS-PAGE純度測定方法并不準確，而CE方法能夠得到更為準確的純度測定結果，因此申請將原有的純度檢測方法由SDS-PAGE改為CE。
     事實上，FDA官員也非常傾向于在新生物制品的報批材料中使用CE技術作為等電點、純度、糖基化等數據的測定手段。對于傳統凝膠電泳的數據，FDA官員對其可靠性及準確性持保留態度，而CE得到的數據要比凝膠電泳準確的多，這是FDA官員非常愿意接受CE技術結果的主要原因。2008年，諾華公司位于意大利的疫苗研發中心(NVGH)開發的新型蛋白質抗原疫苗在報批時由于使用SDS-PAGE作為純度檢測標準，FDA官員對其數據可靠性質疑，并非常明確的建議其使用CE技術重新對純度進行檢測。
     在歐洲藥典及美國藥典中，毛細管電泳的檢測方法也不斷豐富與發展。毛細管電泳技術早出現在藥典中的方法是促紅細胞生成素(EPO)的糖異構體測定，及得到不同糖型EPO異構體之間的百分比例。糖蛋白的異構體差異是非常微小的，普通的分析方法不能將EPO主要的幾種異構體分離定量。Amgen公司使用CE技術解決了EPO產品中各種糖基化異構體的分離定量問題，這一方法即被歐洲藥典和美國藥典確定為EPO分析的標準。2005年歐洲藥典委員會組織14家實驗室及生物制藥廠家進行了重組生長激素(Somatropinum)的CE分析實驗。結果一致表明CE比膠條等電聚焦方法更準確、穩定、簡單、快速。在2006年歐洲藥典增補版上，這一方法被列為生長激素大分子相關雜質檢測標準。目前在歐洲藥典上已經有包括EPO、重組生長激素、谷胱甘肽、抑肽酶等超過10種的藥品需要用CE方法來進行檢定。隨著CE技術在生物制藥領域的快速發展，以及新的蛋白質藥物/疫苗的不斷上市，將會有更多的CE方法出現在各權威藥典中。

    蛋白質生物制品的分子量和純度分析

     PA800 plus生物制品分析系統采用毛細管電泳技術全自動地實現蛋白質分子量的測定、純度測定。在線紫外檢測進行準確定量，無須傳統繁瑣的制膠和染色程序，因此可快速地完成蛋白質的鑒定。樣品的準備過程與SDS-PAGE大體相同，而分離和檢測在毛細管中進行。采用了新優化的凝膠配方，以確保廣泛分子量范圍的各種蛋白質均可獲得的分辨和檢測效果。ProteomeLab SDS-MW凝膠分析試劑盒（ProteomeLab SDS-MW gel analysis kit) , 對分離凝膠介質進行了優化, 并將操作方法和數據處理做了標準化, 使分子量的測定更加簡單、方便、自動和準確。該試劑盒內包括標準操作方法、對照品、樣品緩沖液和凝膠緩沖液。
     SDS-PAGE方法對蛋白藥物進行純度分析，不僅穩定性不佳，而且分辨率不夠，已經不能滿足生物制品研發和質量控制的要求。ProteomeLab IgG純度/異質性分析試劑盒（ProteomeLab IgG Purity/Heterogeneity AssayKit），特別用于分析鑒定變性和非變性免疫球蛋白等IgG 的性質，分辨率高，可分離出非糖基化重鏈等雜質。其方便、簡單和標準化的方法更是市場上的。例如對于單克隆抗體藥物的純度測定，SDS-PAGE并沒有將樣品中的雜蛋白分離出來，特別是丟失糖鏈的重鏈。而毛細管電泳技術不僅分別率高，而且速度也很快，只需要20幾分鐘即可完成。
      這一方法的穩定性較傳統SDS-PAGE方法高得多，如一個單克隆抗體蛋白的純度測試，連續19次進樣，得到的結果定量RSD（峰面積）<1%；定性RSD（出峰時間）<1% 。
 

    蛋白質等電點的測定和蛋白質異質性的鑒定

    根據蛋白質電荷特性的差異可區分鑒別蛋白, 因此通過測定蛋白質的等電點,可以部分地確定蛋白質的屬性。通過對所分離的不同蛋白質變異株的定量，可以評估其異質性。
    借助PA800 plus 的毛細管等電聚焦(cIEF)的快速和全自動的優勢，可以在線紫外檢測直接定量蛋白質。cIEF方法更、簡單、快速、可區分微小差異、分辨率可達0.01 pH。而且可以提供傳統等點聚焦電泳所無法比擬的重現性。同一個蛋白藥物在不同PA800 plus儀器及不同時間進行的等電點測試得到的結果，一致性非常好，pI測定的CV<0.1% 。
 
    糖蛋白的糖譜分析

    單克隆抗體藥物和重組蛋白藥物均屬于糖蛋白，糖蛋白中的糖基結構對于蛋白藥物在體內的毒性和半衰期等有著非常重要的影響。從糖蛋白中釋放出來的糖基的分析結果，可以作為糖蛋白的指紋圖譜。PA800 plus生物制品分析系統和ProteomeLab 糖標記分析試劑盒（ProteomeLab carbohydrate labeling and analysis kit) 可用于寡糖和單糖的分析或糖蛋白中糖基的分析和糖譜的制作。其提供快速的糖基釋放和快速分離（一般在15分鐘內）。所采用的高靈敏度激光誘導熒光檢測使得樣品的處理過程非常簡單方便，僅需要簡單地稀釋即可快速鑒定分析。
    PA800 plus 所提供的方法的優勢在于：分析特異性好、還原胺化處理和開管模式使得對糖蛋白水解液的分析無須做任何后處理。配套的硬件、標準化分析和數據處理方法、加上的標記和檢測技術也是的。采用APTS 衍生和激光誘導熒光檢測，每個不同的糖分子可產生等量的檢測信號強度，因此可以直接地對其含量進行比較。CE方法分析糖蛋白的糖鏈，不但可以區分出一個糖基的差別，而且對于相同分子量的糖基異構體也可以得到分離。