降落梯度PCR的原理與常見問題解答

   問：降落梯度PCR（Touchdown PCR）的原理？
   答：Touchdown PCR是指每隔一個循環降低1°C反應退火溫度，直至達到“Touchdown”退火溫度，然后以此退火溫度進行10個左右的循環。該方法初出現是為了避開確定退火溫度而進行的復雜的反應優化過程。正確和非正確退火溫度之間的任何差異將造成每個循環PCR產物量的兩倍差異（每攝氏度造成4倍差異）。因此相對于非正確產物，正確的產物可以得到富集該方法的另一個應用是在確定已知序列肽的DNA序列。
   具體過程如下：使用兩套與已知序列肽兩末端可能配對的簡并引物，這只需要知道一段長為13個氨基酸的肽段序列，5’和3’引物各長18個堿基（6個氨基酸），兩者之間有一個堿基以上的間隔。使用簡并引物即可以進行“Touchdown PCR”。由這種方法將獲得大量的產物，但因為由肽序列可以知道引物之間的確切距離，所以可以根據產物的大小來選擇所需要的產物。該方法的優點在于可以富集引物與模板正確配對的產物。如果克隆和測需一打PCR產物，將可以確定肽的正確編碼序列，設計進行雜交的寡核苷酸等。該技術特別適用于由Ser，Lys和Arg（每個有6個密碼子）構成的多肽。
   問：降落梯度PCR的優點？
   答：綜合比較普通梯度PCR技術和耐受量聚合酶鏈反應，認為前者程序簡單，省時，一般的PCR擴增儀都可完成，但缺點是退火溫度不適當時容易出現假陽性;而耐受量聚合酶鏈反應雖然程序復雜，需要擴增儀有較大的內存，但能非常有效地降低或避免假陽性，且不在理想的工作條件（比如鎂離子濃度）下也可擴增出產物。
   這就是降落PCR技術的優點吧。不過我認為。如果能用普通PCR技術擴出來的話，盡量用普通的聚合酶鏈反應，雖然降落聚合酶鏈反應比較省事省力，但是，它在一個很寬的退火溫度里擴增，亂七八糟的條帶肯定比較多哈。雖然，電泳可能看不到。
   降落PCR的一個優點是可以增加某些基因的特異性,不僅我自己在擴基因的艱難歷程中,發現了這一優點,而且也推薦給周圍的人,如果常規PCR循環程序的基因擴增效果不佳,我就來熱啟動加降落PCR.在非特異性背景較高的情況下,這招的確有效,但不。
   問：溫度梯度PCR功能與降落PCR功能的區別？如：溫度梯度PCR,如25個循環的退火溫度為50℃~60℃，40秒；和降落PCR有什么不同之處，退火溫度從60℃~50℃，10個循環，每個循環降低1℃；效果是不是都是一樣？
答：溫度梯度PCR是指在退火溫度不太明確時，為了找到優退火溫度，在一臺PCR儀上同時做多管PCR，每一管放在儀器內不同列（有的是不同行）上，分別進行PCR（如50℃~60℃可以分6管，分別為50，52，54，56，58，60度），后看看哪個溫度的效果。總之是用來進行退火溫度優化的。
   降落PCR是在同一個PCR管內進行PCR，只是每個循環的溫度不同（如每個循環降1度）。一般兼并引物用這種方法多些。
   問：我的兩條引物說明書的Tm值分別為69℃、62℃，若用降落PCR如何設定溫度范圍？
   答：這兩個TM值相差有點大,一般不要超過三度,我認為你的退火溫度就在62,63度左右,你可以先試試,如果你想做降落梯度PCR,那么你可以先用高的退火溫度做幾個循環,然后在換到較低退火溫度做幾個循環,然后再用更低的溫度做剩下的循環,對于你這個,你可以先用65度左右做5個循環,然后在60度左右做5個循環,其余在58度做剩下的循環,只是經驗,不一定能出來.

   問：什么情況下需要做降落梯度PCR？
   答：主要是在出現非特異條帶時可以考慮用降落梯度PCRhttps://www.jntckj.cn/,在高的退火溫度下做幾個循環,這樣擴出的產物特異性好,可以做為后續反應的模板,然后再溫度較低的情況下以前面擴出來的較特異的產物做模板,這樣不但特異性好,而且產物也夠多,可以出現很好的結果。

   還有就是在剛合成引物還未經鑒定效果的時候,可以用降落PCR ,但是正如上面說的你的兩個引物的TM值相差的有點大,一般降落是在TM值以下3-5度開始將,每個循環降0.5或1度,降差不多十個循環后,再維持在后一個循環的溫度上,不要擔心后的循環數目不夠,其實只要模板量沒問題,二十個循環足夠了。
   問：剛合成的引物用降落PCR的原因是什么啊？
   答：因為理論計算的TM值用來確定退火的溫度只是一個參考呀,合適的退火溫度會因為各種原因而有所差異,就連PCR儀都會有影響的,我們實驗室就是,好多都是在一臺能拉出條帶,而在另一臺上就拉不出條帶,或者相反的。
   降落（TD）PCR代表了一種完全不同的PCR優化方法。由于開始時的退火溫度選擇高于估計的Tm值，隨著循環的進行，退貨溫度逐漸降到Tm值，并終低于這個水平。此策略有利于確保個引物－模板雜交事件發生在互補的反應物之間，即那些產生目的擴增產物的反應物之間。盡管退火溫度終會降到非特異性雜交的Tm值，但此時目的擴增產物已開始幾何擴增，在剩下的循環中處于超過任何滯后（非特異性）PCR產物的地位。有人研究發現一些本來產生滿意的單一擴增產物的反應采用TD PCR時變得更好進行了。
提醒一下，如果說明書上的Tm值和Oligo或者Primer上分析的差別挺大的，你要以軟件上的計算為準。 我覺的你兩個引物Tm值差的太多，不過你也可試。68度開始，每個循環下降0.5度，或者0.2度，后62度來個20循環。