分光光度法則是通過測定被測物質在特定波長處或波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析。常用的波長范圍為：(1)200～400nm的紫外光區,(2)400～760nm的可見光區,(3)2.5～25μm（按波數計為4000cm<-1>～400cm<-1>）的紅外光區。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計（或比色計）、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。

紫外分光光度計的詳細介紹

　　單色光輻射穿過被測物質溶液時，被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關系如下式：  　　A=-log(I/I。)=-lgT=kLc  　　式中 :A 為吸收度；  　　I。為入射的單色光強度；  　　I 為的單色光強度；  　　T 為物質的比；  　　k 為吸收系數；  　　L 為被分析物質的光程  　　c 為物質的濃度  　　物質對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收系數是該物質的物理常數。當已知某純物質在條件下的吸收系數后,可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區，除某些物質對光有吸收外，很多物質本身并沒有吸收,但可在條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應用標準品或對照品同時操作。

紫外分光光度計結構

　　分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統組成。

紫外分光光度計比色方法

　　一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。  　　Lowry 法：以早期的Biuret 反應為基礎，并有所改進。蛋白質與Cu2 反應，產生藍色的反應物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質的蛋白不適合此種方法。  　　BCA（Bicinchoninine　acid　ay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應產生Cu ，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系強，反應后形成的化合物穩定。相對于Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。  　　Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應，產生的有色化合物吸收峰595nm。其的特點是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍；操作更簡單，速度更快；要一種反應試劑；化合物可以穩定１小時，方便結果；而且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。  　　某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結果Lowry，BCA 測出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質，以BSA作標準品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標準品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，是參照要測試的樣本的化學構成，尋找化學構成類似的標準蛋白作標準品。另外，比色法定量蛋白質，經常出現的問題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是，反應后1011分光光度計的重要配件—— 比色杯的顏色是有的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，的樣品（包括標準樣品），都須在此時間內測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外，重要的是，是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質的比色杯，因為反應后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。

分光光度計的重要配件—— 比色杯

　　比色杯按照材質大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據不同的測量體積，有比色杯和毛細比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定。因為反應中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以須采用性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內測試樣品。  　　由于另外測試的樣品量不同，所以一般分光光度計廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。目前市場已經存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質定量，亦可用于蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量需50μl，比色杯單個包裝，可以回收樣品。如Eppendorf UVette&reg;塑料比色杯，是目前比色杯市場上一個革新。隨著生命科學以及相關學科發展，對此類科學的實驗研究提出更高的要求，分光光度計將是分子生物學實驗室的儀器，也成為微生物、食品、制藥等相關實驗室的備設備之一。

紫外分光光度計使用方法
1.接通電源，打開儀器開關，掀開樣品室暗箱蓋，預熱10分鐘。  　　2.將靈敏度開關調至“1”檔（若點調節器調不到“0”時，需選用較。）  　　3.根據所需波長轉動波長選擇鈕。  　　4.將空白液及測定液分別倒入比色杯3/4處，用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室內，使空白管對準光路。  　　5.在暗箱蓋開啟狀態下調節點調節器，使讀數盤指針指向t=0處。  　　6.蓋上暗箱蓋，調節“100”調節器，使空白管的t=100，指針穩定后逐步拉出樣品滑竿，分別讀出測定管的光密度值，并記錄。  　　7.比色完畢，關上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。  

紫外分光光度計注意事項

　　1、紫外分光光度計應放在干燥的房間內，使用時放置在堅固平穩的工作臺上，室內照明不宜太強。熱天時不能用電扇直接向儀器吹風，燈泡燈絲發亮不穩定。  　　2、使用本儀器前，使用者應該先了解本儀器的結構和工作原理，以及各個操縱旋鈕之功能。在未按通電源之前，應該對儀器的性能進行檢查，電源接線應牢固，通電也要良好，各個調節旋鈕的起始位置應該正確，然后再按通電源開關。  　　3、在紫外分光光度計尚未接通電源時，電表指針須于“0”刻線上，若不是這種情況，則可以用電表上的校正螺絲進行調節。

關系式