小鼠雙鏈DNA體/天然DNA體(dsDNA)ELISA試劑盒檢測原理

Elisa試驗是一種敏感性高，特異，重復性好的實驗診斷方法。由于其試劑穩定、易保存，操作簡便，結果判斷較客觀等因素，已廣泛應用在免疫學檢驗的各領域中。依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測體，經過溫育并徹底洗滌。用底物T顯色，T在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

小鼠雙鏈DNA體/天然DNA體(dsDNA)ELISA試劑盒樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素凝。3000轉離心30分鐘取上清。

3.  細胞上清液：3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1.     酶標儀（450nm）

2.     高加樣器及頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.     37℃恒溫箱

小鼠雙鏈DNA體/天然DNA體(dsDNA)ELISA試劑盒操作注意事項

1.  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正常現象，水浴加熱使結晶溶解后再使用。

2.  實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.  標準品稀釋液即可視為陰性對照或者空白；預處理后的樣本無需稀釋，直接取10μL加樣即可。

4.  嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5.  液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

注：標準品用標準品稀釋液依次稀釋為：80、40、20、10、5、2.5 pg/ml

試劑的準備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩盡孔內液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.  自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

小鼠雙鏈DNA體/天然DNA體(dsDNA)ELISA試劑盒操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.  待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

4.  隨后標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

Elisa包被的條件

包被用原或體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH 等應根據試驗的特點和材料的性質而選定。體和蛋白質原一般采用 pH9.6 的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2 的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL 緩沖液作為稀釋液的。通常在 ELISA 板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2 小時被認為具有同等的包被效果。包被的適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-2 0ug/ml。

封閉

封閉 (blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。原或體包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA 其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的手續與包被相類似。常用的封閉劑是0.05%-0.5%

的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其的特點是價廉，可以高濃度使用(5%)。高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。封閉是否要，取決于 ELISA 的模式及具體的實驗條件。并非的ELISA 固相均需封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來，雙體夾心法，只要酶標記物是高的，操作時洗滌徹底，不經封閉也可得到滿意的結果。是用單腹水直接包被時，因其中大量非體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的(見2.2.2)。包被好的E LISA 板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數月。

結合物

結合物即酶標記的體(或原)，是 ELISA 中關鍵的試劑。良好的結合物應該是既保有酶的催化，也保持了體(或原)的免疫。結合物中酶與體(或原)之間有恰當的分子比例，在結合試劑中應盡量有或少含有游離的(未結合的)酶或游離的體(或原)。此外，結合物尚要有良好的穩定性。

小鼠雙鏈DNA體/天然DNA體(dsDNA)ELISA試劑盒結合物的制備

酶標記體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯法和過碘酸鹽氧化法。

( 1)戊二醛交聯法：戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質的氨基通過它而聯結。堿性磷酸一般用此法進行標記。交聯方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與體的混合物中，反應后即得酶標記體。ELISA 中常用的酶一般此法交聯。它具有操作簡便、(結合率達60%-70%)和重復性好等優點。缺點是交聯反應是隨機的，酶與體交聯時分子間的比例不嚴格，結合物的大小也不均一，酶與酶，體與體之間也有可能交聯，影響效果。在兩步法中， 先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與體作用而形成酶標體。也可先將體與戊二醛作用，再與酶聯結。兩步法的產物中大部分的酶與蛋白質是以1:1 的比例結合的，較一步法的酶結合物更有助于本底的以敏感度，但其偶聯的率較一步法低。

( 2)過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用此法。反應時，過碘酸鈉將HRP 分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成 Schiff 氏堿而結合。酶標記物按克分子比例聯結，其比例為：酶/體=1-2/1 。此法簡便，一般認為是HRP 可取的標記方法，但也有人認為試劑較為強烈，各批實驗結果不易重演。

按以上方法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和體。理論上，結合物中混有的游離酶一般不影響 ELISA 中后的酶測定，因經過徹底洗滌，游離酶可被除去，并不影響終的顯色。但游離的體則不同，它會與酶標體競爭相應的固相原，從而減少了結合到固相上的酶標體的量。因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和體后用于檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應用。銨鹽析法為簡便，但效果并不理想，因為此法只能去除留在上清中的游離酶，但相當數量的游離體仍與酶結合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，液相層析法可將制備的結合物清晰地分成三個部分：游離酶、游離體和純結合物而取得的分離效果，但費用較貴。

結合物制得后，在用作 ELISA 試劑前尚需確定其適當的工作濃度。使用過濃的結合物，既不經濟，又可使本底增高；結合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以須對結合物的濃度予以選擇。適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的靈敏度，合適

的測定條件和測定費用的節省。就酶標體本身而言，它的工作濃度是指與其相應原包被的載體作試驗時，能得到陽性反應的稀釋度。例如某一 HRP：人IgG 制劑標明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經1:5000 稀釋后，在與人 IgG 包被的固相作ELISA試驗時，將發生陽性反應。但在用于具體的ELISA檢測中，酶標體的適工作濃度受到固相載體的性質、包被原或體的純度以及整個檢測系統如標本、反應溫度和時間等的影響，因此須在實際測定條件下進行"滴配"選擇能高敏感度的稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。